Ni Made Ayu Marthini mengawali karir sebagai Pegawai Negeri Sipil (PNS) di Kementerian Luar Negeri Republik Indonesia pada tahun 1996. Posisi yang pernah dijabatnya antara lain, staf pada Direktorat Kerja Sama Ekonomi Multilateral (KSEM) Ditjen Hubungan Ekonomi Luar Negeri (HELN) sebelum ditugaskan pada Misi Tetap Republik Indonesia (PTRI) untuk Perserikatan Bangsa-Bangsa di New York, Amerika Serikat (Januari 2001- Desember 2004). Setelah kembali ke Indonesia pada tahun 2004, beliau menjabat sebagai Kepala Sub Divisi Perjanjian Perdagangan Luar Negeri, Direktorat Ekonomi dan Lingkungan Hidup PBB.
Setelah bekerja selama 10 tahun di Kemlu, Made Marthini pindah ke Kementerian Perdagangan pada tahun 2006 dan menjabat beberapa posisi seperti Eselon IV di Biro Hukum, dan Kepala Bidang Berita & Publikasi di Pusat Hubungan Masyarakat. Pada saat yang sama, beliau juga ditugaskan sebagai Asisten Menteri Perdagangan di kantor Menteri selama enam tahun, sebelum akhirnya ditugaskan sebagai Atase Perdagangan Indonesia di Washington D.C. Amerika Serikat (Oktober 2011-Agustus 2015).
Sekembali dari Washington DC, Made menjabat sebagai Kapus Harmonisasi Kebijakan dan Kapus Isu-isu Strategis (2015-2016). Pada 2016 - 2021, beliau menjabat sebagai Direktur Perundingan Bilateral Kementerian Perdagangan RI. Pada posisi tersebut, beliau mengawasi 19 negosiasi perdagangan bilateral Indonesia dengan para mitra dagang dimana 7 Perudingan Dagang yang dapat diselesaikan, yaitu Indonesia dengan EFTA, Chile, Australia, Mozambique, Jepang (Review), Pakistan (Review) dan Palestina. Pada akhir masa jabatannya, beliau meraih penghargaan kategori Pejabat Pimpinan Tinggi Pratama Teladan, Anugerah ASN 2021 dari Kementerian Aparatur Sipil Negara atas Prestasi, Kepemimpinan dan Inovasinya.
Pada tanggal 3 Oktober 2022, Menteri Pariwisata dan Ekonomi Kreatif melantik beliau sebagai pejabat Pimpinan Madya, Deputi Bidang Pemasaran Kementerian Pariwisata dan Ekonomi Kreatif dengan tugas untuk meningkatkan pergerakan wisatawan nusantara (domestik) dan menambah wisatawan mancanegara yang berkualitas serta menjaga citra Pariwisata dan Ekonomi Kreatif Indonesia.
Made Marthini meraih S1 dari Universitas Gajah Mada jurusan Hubungan Internasional (1995), Lulus S2 meraih Master of Science dari the London School of Economics di Inggris (1999) dan menyelesaikan Executive Education, Mastering International Trade di Harvard Kennedy School of Government, A.S. (2015).